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BACTOX, un rapido Bioassay che utilizza protozoi per valutare la tossicità di batteri ASTRATTO Un nuovo tipo di test di tossicità sulla base dei protozoi Tetrahymena pyriformis è stato sviluppato per valutare la tossicità complessiva di ceppi batterici dati come preda. Questo test semplice e rapido è in grado di rilevare i batteri agenti tossici che producono, che possono presentare un rischio biologico. Può essere utilizzato anche per la valutazione del rischio di microbi progettati per deliberata. Molti test di tossicità per determinare effetti acuti e cronici sono disponibili per la valutazione del monitoraggio e del rischio di nuove sostanze chimiche e xenobiotici o per la valutazione della tossicità degli inquinanti ambientali. La scelta dell'organismo più adatto per tali saggi biologici è determinata dalle sostanze da valutare e della sensibilità dell'organismo (5). Ad esempio, linee cellulari ingegnerizzate stanno diventando uno strumento per la proiezione di analoghi dell'ormone (8), e le alghe sono efficaci per testare la fitotossicità di composti che agiscono sul pathway fotosintetica (16). Gli inquinanti ambientali e sostanze tossiche sono valutati con i vari organismi (1. 7. 9. 11. 15. 18), tra cui protozoi, prevalentemente Tetrahymena (2. 7, 13. 14. 21). Solitamente, gli organismi di prova sono esposti a singoli prodotti chimici o inquinanti ambientali presenti in acqua, ma non a interi batteri. I batteri sono sempre più coinvolti in molte applicazioni biotecnologiche, compresa la produzione di sostanze bioattive, controllo dei parassiti, e la protezione delle piante. Per fornire i dati tossicologici questi batteri come richiesto, ad esempio autorità regolatorie (10), le usuali prove di tossicità non sono applicabili in quanto sono saggi basati sulle sostanze chimiche in soluzione. Nessuna saggio biologico per valutare la tossicità generale dei microrganismi è stata descritta finora. Vi presentiamo un nuovo tipo di saggio biologico semiquantitativo per valutare la tossicità batterica globale sulla base dei protozoi Tetrahymena pyriformis alimentati con i batteri presenti naturalmente o geneticamente modificati. Morti tra i protozoi sono monitorati, e il tasso di mortalità è utilizzato per valutare la tossicità dei batteri. T. pyriformis è stato scelto perché è uno standard ben riconosciuto per i test di tossicità (4. 6. 13-15. 17). Lo scopo del test BACTOX è la rilevazione della tossicità generale dei ceppi surrettizie che sintetizzano metaboliti tossici secondari (Sostanze tossiche) e che possono costituire un rischio biologico. Il suo scopo non è la rilevazione di tossine specificamente mirati, dal momento che i batteri possono produrre diversi metaboliti tossici contemporaneamente (sinergie). Questo tipo di saggio biologico è di rilevanza ecologica, dato che controlla una interazione trofica al primo livello della rete alimentare. Questo test che utilizza protozoi è il primo di questo tipo che può essere utilizzato sia per la rivelazione di sostanze tossiche batteriche e per la valutazione del rischio di ceppi batterici. Ceppi e la preparazione di microrganismi. I ceppi utilizzati e le loro fonti sono elencati nella tabella 1. Oltre ai ceppi di riferimento provenienti da collezioni cultura ufficiale (American Type Culture Collection [ATCC], Rockville, MD .; collezione nazionale di culture Tipo [NCTC], Londra, Regno Unito; e Deutsche Sammlung von Mikroorganismen [DSM], Braunschweig, Germania), la maggior parte dei ceppi origine da programmi di screening per l'isolamento dei batteri che producono sostanze antimicotiche o insetticide, ad esempio, Novartis biosicurezza Bactox Collection [NBBC], Novartis Pharma AG, Basilea, Svizzera). Il ceppo CHA0 radice-colonizzare Pseudomonas fluorescens (19), codificato NBBC 267, è stato utilizzato, e quindi erano alcuni dei suoi derivati, che variano nella produzione di metaboliti secondari. Ad esempio, P. fluorescens CHA0-Rif / pME3424 (12), codificato NBBC 268, contiene un plasmide responsabile per la sovrapproduzione di antibiotici 2,4-diacetylphloroglucinol e pyoluteorin. Tutti i batteri sono stati coltivati su terreno agar triptone soia a 25 ° C per 3 giorni per consentire un confronto diretto, se l'uso di altri mezzi potrebbe influenzare la produzione di metaboliti batterici. Un'ansata 1-microlitri di batteri sono stati risospesi in 1 ml di acqua di rubinetto sterile, che corrisponde ad un valore di circa 5 McFarland o ad una concentrazione di 10 8 a 10 9 cellule ml -1 (come determinato mediante diluizione e placcatura su triptone agar di soia). ceppi batterici utilizzati in questo studio T. pyriformis GL (ATCC 30327) (3) è stato coltivato axenically ad una densità di circa 10 5 protozoi ml -1 a 1% medio proteoso peptone arricchiti con estratto di lievito 0,1% a 25 ° C in fiasche di coltura tissutale. I protozoi sono stati quindi centrifugati a 200 g per 1 min. Il surnatante è stato rimosso, e le protozoi sono stati risospesi in membrana filtrato (dimensione dei pori 0,22 micron) e autoclavabile acqua di rubinetto ad una densità finale di 1 × 10 4 a 3 × 10 4 cellule ml -1. Il numero di cellule è stata misurata con un contatore di cellule CASY (Schaerfe sistema, Reutlingen, Germany) tarato ad una soluzione 30 mM NaCl. Prima sono stati aggiunti i batteri, protozoi sono state incubate a 25 ° C per 30 min per adattarli alla pressione osmotica inferiore del rubinetto prima dell'inizio del test. Filtrata, l'acqua del rubinetto in autoclave è stato utilizzato nel corso della prova, perché l'acqua del rubinetto migliori imita l'osmolarità degli habitat naturali di Tetrahymena e sterilizzazione elimina cloro residuo. Se è richiesto un elevato livello di standardizzazione, tuttavia, acqua distillata modificato con basse concentrazioni di minerali ( "artificiale" acqua dolce) può anche essere usato (20). Peptoni del terreno di coltura protozoo possono reagire con metaboliti batterici e diminuire la loro tossicità. Pertanto, il test deve essere eseguito solo in acqua dolce, anche se T. pyriformis prontamente ingerisce batteri in presenza di nutrienti disciolti. sono state osservate risposte deboli o falsi negativi quando il test è stato effettuato nel mezzo di crescita protozoo. saggio biologico standard. La prova è stata effettuata a 25 ° C in piastre di polistirene non-trattati in superficie 12 pozzetti che consentivano conveniente esame microscopico ripetitivo. Ogni pozzetto contenute 1 ml di sospensione batterica a cui è stato aggiunto 500 ml di sospensione protozoo. Il volume totale di 1,5 ml era abbastanza grande da evitare effetti negativi di evaporazione durante il decorso del dosaggio. Le concentrazioni finali di microrganismi erano 3 × 10 4 ml -1 per pyriformis T. e 10 8 a 10 9 ml -1 per i batteri. ingestione batterica e lisi dei protozoi sono stati osservati con un microscopio invertito con un ingrandimento 125 volte. L'intera superficie di ciascun pozzetto è stata monitorata dopo 10 min e dopo 2, 4, e 8 h. Ogni ceppo batterico è stato analizzato più volte al fine di verificare la riproducibilità dei risultati e l'affidabilità del test. Una sospensione protozoo senza batteri è stato usato come controllo per ogni piatto. Escherichia coli K-12 ceppo W3110 (DSM 5911) o ceppo HB101 (DSM 1607) è stato anche abitualmente utilizzati come controllo negativo. P. fluorescens NBBC 267 e NBBC 268 sono stati scelti come ceppi di riferimento per debolmente e fortemente controlli positivi, rispettivamente. Il test BACTOX come strumento per monitorare la tossicità batterica. Vari batteri sono stati testati, e in alcuni casi una lisi progressivo del protozoi, che era una chiara indicazione di tossicità, si è verificato. Nel caso illustrato in Fig.1. lisi complessivo richiesto 10 min con la progressione presentata in Fig. 1 a a d. Occorre più tempo per ottenere la stessa risposta per i batteri meno dannose. osservazioni al microscopio devono essere effettuate periodicamente al fine di monitorare l'evoluzione della popolazione protozoo, dal momento che gli organi protozoi lisati sono rapidamente cannibalizzati dai superstiti e proteine rilasciate possono inattivare le sostanze tossiche. Circa il 10% della popolazione protozoo non ingerire batteri. Come una procedura operativa standard, si consiglia il monitoraggio dopo 10 min e dopo 2, 4 e da 6 a 8 ore. osservazioni successive sono inutili, dal momento che gli effetti nocivi non sono mai stati osservati dopo 8 ore. Per stimare l'intensità dell'effetto nociva dei batteri testati, la proporzione di protozoi morti stata determinata microscopicamente. Si propone scala facile da giudicare, con posizionamento da 1 a 5 come mostrato in Fig. 2. Una scala più grande non sarebbe adeguato alla sensibilità del test. Effetto di batteri nocivi per pyriformis T.. La lisi della protozoi come illustrato progressivamente pannelli A a D si verifica più o meno rapidamente, a seconda del ceppo batterico alimentato. Dopo soli 10 minuti di incubazione con P. fluorescens NBBC 268, l'intera popolazione di protozoi era morto (d). Le immagini sono state prodotte da Nomarski microscopio a contrasto di interferenza differenziale (DIC). Scala per la quantificazione del test BACTOX. Le varie fasi corrispondono alle seguenti effetti sulla popolazione protozoo: 1, nessun effetto, cioè il 100% della protozoi sono sani; 2, debole, solo pochi protozoi guardare significativamente ridotta rispetto al controllo; 3, forte, con circa il 50% dei morti protozoi; 4, molto forte, con solo pochi protozoi ancora in vita; e 5, il massimo, cioè tutti i protozoi sono morti. Le immagini sono state prodotte da DIC. Le risposte tipiche osservate con batteri diversi. Esempi di batteri che causano diversi livelli di effetti sono presentati nella Tabella 2. Nessun effetto rilevabile è stata osservata con batteri come E. coli K-12 o B o Lactococcus lactis. All'altra estremità della scala, P. fluorescens NBBC 268 ucciso quasi tutti protozoi entro 10 min. Per un tale effetto immediato abbia luogo, si deve presumere che il metabolita attivo (s) è stato disciolto nel mezzo di prova, poiché i protozoi non ha avuto il tempo di ingerire molti batteri. Altri batteri necessari un paio d'ore per sviluppare il loro effetto nocivo. Tossicità che si sviluppa lentamente può indicare che la sostanza tossica è meno attivo o viene sintetizzata in quantità più piccole o che possa essere liberata o attivato durante il processo di digestione. Effetti di ceppi batterici presi come riferimento e di varie concentrazioni batteriche sulla protozoi un La sensibilità del test è stata valutata con un totale di 258 ceppi; tra questi, 106 ceppi erano attive (non mostrato). Appartenevano a batteri Gram-positivi o gram-negativi di 22 diversi generi. L'alta percentuale di ceppi attivi ottenuti (41%) è un'indicazione che il test è in grado di rilevare varie sostanze tossiche ed è pertanto applicabile a diversi tipi di batteri. Abbiamo valutato la tossicità generale dei batteri di protozoi e non la risposta di protozoi a tossine specifiche, poiché i batteri producono comunemente diverse sostanze tossiche contemporaneamente. pertinenti concentrazioni di protozoi e batteri. Era necessario valutare la gamma concentrazione ottimale di protozoi. Sopra una concentrazione di 10 5 cellule ml -1. artefatti affollano possono influenzare il risultato, e la densità delle cellule al di sotto di 10 ml 3 -1 sono troppo bassi per un'osservazione comoda. Le variazioni tra questi limiti di concentrazione non hanno alterato l'esito dei risultati del test. Così, le misurazioni altamente standardizzati di densità di cellule protozoi non sono necessari. Abbiamo studiato gli effetti di diverse concentrazioni batteriche sul risultato dei risultati del test. Un innocuo ceppo di E. coli applicato a 10 o 100 volte la concentrazione di principio non ha prodotto alcun effetto tossico (Tabella 2). Un risultato falso positivo a causa di sovraffollamento ad alta densità batterica può quindi essere esclusa. Inoltre, un errore portando a più di una concentrazione 10 volte di batteri non è realistico, perché la torbidità risultante renderebbe leggere il test troppo difficile. Una diluizione di 10 volte di un ceppo moderatamente tossico che svolge la sua attività durante il ciclo di digestione (ad esempio P. fluorescens NBBC 267) non ha cambiato il risultato. Questo potrebbe essere dovuto al comportamento alimentare, dal momento che i protozoi monitorare la loro preda attivamente e concentrarsi nei loro vacuoli digestivi. Una diluizione di 10 volte del ceppo ad azione rapida NBBC 268, tuttavia, indebolito l'effetto tossico di due livelli sulla scala. Questo risultato rafforza l'ipotesi che in questo caso, la sostanza tossica viene sciolto in soluzione. Per ottenere la massima sensibilità, il test BACTOX deve essere effettuata alla concentrazione batterica ottimale. Affidabilità e riproducibilità del test. I livelli indicati nella tabella 2 sono valori medi ottenuti da diverse ripetizioni dell'esperimento. Per tutti i ceppi batterici innocue che ha mostrato un valore di 1, anche dopo 8 ore di incubazione, alti livelli di tossicità non sono mai stati osservati durante almeno 10 ripetizioni dell'esperimento. Le variazioni tra i livelli di tossicità osservati durante ripetizioni dell'esperimento erano raramente più di un livello, ed erano dovute a differenze sia in valutazioni visive e del tempo impiegato per gli effetti dannosi per lo sviluppo. Risultati con batteri appartenenti a diversi gruppi tassonomici. La prova è stata effettuata con vari tipi di batteri per valutarne l'efficienza e di confrontare i risultati con la loro classificazione in gruppi rischio biologico (RG). I ceppi BACTOX-positivi sono stati classificati in RG1 e RG2 sia dei National Institutes of Health (NIH) o la normativa europea (UE). Alcuni esempi significativi sono presentati in Tabella 3. I risultati del test BACTOX con alcuni gruppi tassonomici rilevanti di batteri a In linea con la loro classificazione, le K-12 e B ceppi di E. coli ha mostrato alcuna attività, mentre quattro su cinque wild-type isolati fatto. Non sono stati rilevati ceppi attivi dei food-grade batteri L. lactis, ma tutti i patogeni ceppi di Staphylococcus aureus testati sono stati nocive (tabella 3). I ceppi del altamente specifico insetto thuringiensis patogeno Bacillus erano innocui per Tetrahymena. e così erano il cibo-avvelenamento ceppi Bacillus cereus. Quest'ultima specie è classificata in RG2 UE, ma i ceppi testati non erano di origine clinica. Un numero significativo di ceppi classificati in RG1 UE e affini ai gruppi biotecnologico importanti P. fluorescens e Streptomyces spp. presentato una attività molto alta. L'ampia gamma ottenuto sulla scala di tossicità in quei gruppi rivela che la produzione di metaboliti attivi è più ceppo specifico di specie. Le proprietà tossiche di ceppi di recente isolati devono pertanto essere valutati prima crescita su larga scala (10), al fine di determinare il livello di biosicurezza adeguato contenimento fisico. valutazione del rischio raffinato o ulteriori misure di sicurezza possono essere implementate per BACTOX-positivi ceppi classificati in RG1 UE. risultati BACTOX negativi, tuttavia, non escludono la possibilità di effetti nocivi. Conclusione. Presentiamo un nuovo tipo di test biosicurezza base ai pyriformis protozoo T.. che non è paragonabile ad altri test di tossicità. Esso consente il monitoraggio di batteri potenzialmente pericolosi presi come tale anziché il monitoraggio dei singoli prodotti chimici. L'organismo di prova è anche naturalmente bacteriotrophic, che lo rende più attuale che le prove di tossicità convenzionali per studi di impatto ambientale che coinvolgono batteri deliberatamente rilasciati. Questo test può essere applicato nella valutazione del rischio di batteri geneticamente modificati o wild-type, che possono presentare proprietà tossiche. RINGRAZIAMENTI Ringraziamo D. Haas, H. J. Halfmann, H. J. Kempf, U. Schnider, e K. Seeboth per fornire gentilmente batteri; R. Peck per il ceppo protozoo; e C. M. Fischer per le correzioni. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero (Priorità programma Biotecnologia, concedere no. 5002-35.145) e da Novartis Pharma AG. NOTE Ricevuto 25 settembre 1998. Accettata il 18 marzo 1999. ↵ * Autore corrispondente. Indirizzo postale: Novartis Pharma AG, K-135.P.16, CH-4002 Basilea, Svizzera. Telefono: 41-61-696.58.01. Fax: 41-61-696.16.49. E-mail: pharma. novartis. com bernard. jenni. RIFERIMENTI Baird D. J. Barber I. 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